Site Rengi

BilgiliUsta.com | Aradığınız Her Bilginin Adresi.

Gen Nakavtı Usuli

  • 01 Mayıs 2021
  • Gen Nakavtı Usuli için yorumlar kapalı
  • 234 kez görüntülendi.

Gen nakavtı; bir geni çıkararak, hücre veya organizma üzerindeki tesirleri gözlemleyerek genlerin işlevini araştırmak için kullanılan moleküler biyoloji usulüdür. Geni tamamen silerek, gene değişinimler sokarak, genin ekspresyonunu baskılayarak veya olgun organizmada geni tertip ederek muvaffak olunabilir. Gen Nakavt Usulleri Suni gen nakavt organizmasını oluşturmak için, ilgilenilen geni susturmak veya çıkarmak için birkaç usul kullanılır. Gen nakavt usulleri […]

Gen nakavtı; bir geni çıkararak, hücre veya organizma üzerindeki tesirleri gözlemleyerek genlerin işlevini araştırmak için kullanılan moleküler biyoloji usulüdür. Geni tamamen silerek, gene değişinimler sokarak, genin ekspresyonunu baskılayarak veya olgun organizmada geni tertip ederek muvaffak olunabilir.

Gen Nakavt Usulleri

Gen Nakavtı YöntemiSuni gen nakavt organizmasını oluşturmak için, ilgilenilen geni susturmak veya çıkarmak için birkaç usul kullanılır. Gen nakavt usulleri şunlardır:
• Gen susturma
• Şartlı nakavt
• Homolog rekombinasyon
• Gen sonu
• Değişinime göre nakavt

Değişinim ile Gen Nakavt

Değişinim yoluyla gen nakavt genellikle bakterilerde hakikatleştirilir. Bu tekniğin Escherichia coli’de kullanılmasının erken bir misali 1989 senesinde Hamilton ve dostları tarafından uygulanmıştır. Bu deneyde, geni silmek için iki ardışık rekombinasyon kullanılmıştır. Bu çalışma, bakterilerdeki fonksiyonel bir genin çıkarılması veya değiştirilmesinin fizibilitesini oluşturmuştur. Bu usul o zamandan beri öteki organizmalar, özellikle de fareler gibi araştırma hayvanları için geliştirilmiştir.
Nakavt fareleri, hastalık için ehemmiyeti olabilecek insan eşdeğerlerine sahip genleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Nakavt fareleri kullanan bir araştırmanın son misali, Ani Açıklanamayan Gece Vefat Belirtisinde SUNDS Xirp proteinlerinin ve Çin Han Popülasyonunda Cheng ve dostlarının Brugada Belirtisindeki rollerinin incelenmesidir .
Analistler, iki belirtili bireylerde Xirp genlerini taradılar ve patojenik olabilecek iki gen varyantı tanımladılar. Xirp2 nakavt fareleri kullanarak, Xirp2 kapsamayan fare kalplerinin bir ekip anormalliklere sahip olduğunu bilmişlerdir. Bu çalışma, SUNDS ve Brugada belirtisinde rol oynama ihtimali bulunan Xirp varyantlarının belirlenmesine ve Xirp2’nin kalp işlevindeki rolünü ortaya koymasına izin vermiştir.

Gen Susturma

Gen susturma veya Ribo Nükleik Asit etkileşimi RNAi, gen nakavt çalışmaları için popüler hale gelen daha yeni bir teknolojidir. RNAi’de, belli bir gen için haberci Ribo Nükleik Asit’yı inaktive etmek için ufak karışan Ribo Nükleik Asit siRNA veya kısa saç tokası Ribo Nükleik Asit shRNA kullanılmaktadır. Bu, gen ekspresyonunu tesirli bir biçimde bastırır. RNAi kullanılarak gen susturulması, Bcl-2 ve p53 gibi onkogenlerin yanı gizeme nörolojik hastalık, kalıtsal bozukluklar ve viral enfeksiyonlarda yer alan genleri amaçlamak için kullanılmıştır.

Şartlı Nakavt

Gen silinmesini kullanan nakavt usulleri, erken gelişimde yer almayan genleri araştırmak için eforlu olmuştur. Bununla beraber, erken gelişim sırasında faal olan genler, organizmaya öldürücü bir tesir olmaksızın genellikle elenemez. Şartlı nakavt bunun üstesinden gelmenin bir yoludur. Orijinal şartlı nakavt usulü, LoxP olarak öğrenilen kısa maksat sekansları yine birleştiren Cre ismi verilen bölgeye has bir rekombinaz kullandı. O zamandan beri başka rekombinazlar geliştirildi ve koşullu nakavt çalışmaları için kullanılmıştır.
Evvelki usullerden ikisini birleştiren Kuhn, et al Ribo Nükleik Asit’sının shRNA ekspresyonunu hakimiyet etmek için Cre rekombinaz veya doksisiklin kullanılarak farelerde gen susturulmasının indüklenmesi için bir 2010 yazısında bir usulü tarif eder. Usul, demonte farelerin yinelenebilir yapımı ile sonuçlanmıştır.

Gen Tertip Etme

Gen Nakavtı YöntemiÇinko parmak nükleazları ZFN’ler, transkripsiyon aktivatörü eşi efektör nükleazlar TALEN’ler ve kumpaslı aralıklarla kümelenmiş kısa palindromik tekerrür CRISPR gibi gen tertip etme sistemleri, bölgeye has rekombinazlara karşı ortaya çıkan bir seçenektir. Bu enzimler, kopyalama gibi moleküler biyolojide bir hayli esas usulün yerini almaya başlamıştır. Şartlı gen nakavt, orijinal vasıtalara göre bazı avantajlara sahip oldukları başka bir misaldir.

Gen Nakavt Süreci

Gen nakavt usulünde bazı süreçleri takip edilmesi gerekir. Bu süreçler şu biçimdedir:
Nakavt için bir gen seçme: Genetik mühendisliği deneylerinin rastgele birindeki ilk adım, maksadı seçmektir, burada maksat, çalışmak veya işlevini kavramak istenilen bir gendir. Bundan sonra, ilgilenilen genle alakalı yapı, uzunluk ve öteki parametrelerin çalışıldığı bazı kuru laboratuvar çalışmaları yapılır. Buna sabrederek, deney için en uygun plazmid seçilir. Ancak bundan evvel, ilgilenilen gen belirlenir ve bir kromozom üzerinde haritalanır.
Vektör üretimi: Vektör, ilgilenilen gen veya başka rastgele bir DNA dizisini maksat hücrelere transfer etmek için kullanılan bir vasıtadır, bunun için genellikle bir plazmid kullanılır. Plazmid, genetik mühendisliği deneyleri için kullanılan bir bakterinin kromozom dışı DNA’sıdır. BAC- bakteriyel suni kromozom vektörü, gen nakavt deneyleri için kullanılır. DNA dizisine, protein yaradılışını yasaklayan bir çerçeve kayması değişinimi ilave edildiği zannedelim.
Bazı ORF’ler başka bir deyişle sarih okuma çerçevelerini genden çıkarılması ve değiştirilmiş bir geni BAC’ye yerleştirilmesi operasyonudur. Bu biçimde daha tehlikesiz bir biçimde, neticeleri doğrulamak için bir işaretçi DNA dizisi de eklenir, genellikle bunun için bir antibiyotik mukavemet geni kullanılır. Bununla beraber, replikasyonun kökeni, promoter sekansı ve tanıma sekansları gibi öteki ehemmiyetli DNA sekanslarından kimileri de plazmide eklenir. Artık plazmidi mutasyona hazırdır.

ES hücrelerine yerleştirme: Şimdi elektroporasyon, sonikasyon veya mikroenjeksiyon gibi suni usuller kullanarak, plazmidi ES hücrelerine yerleştirilir. Embriyonik kök hücreler daha süratli dağılınabilir ve her cins hücreye dağılınabilir. ES hücreleri, olgun fare dokularına dönüşme eforuna sahiptir. Elektroforasyon usulü, elektrik akımı altında hücreye bir genin yerleştirildiği bilim adamları tarafından gen nakavtında kullanılan en iyi tekniklerden biridir ve artık e ES hücreleri plazmidi maksat hücreleriniçindedir.
Maksat geni bulursa, rekombinasyon alana kazanç ve maksat gene bir değişinim eklenir. Ayrıca bir işaretleyici gen dizisi kullanılır, böylece mutant gen dizisi ile beraber, işaretleyici gen dizisi de dönüştürülmüş hücrelerin genomuna ilave edilir. Şimdi dönüştürülmüş hücrelee neomisin kapsayan civara geliştiriliyor, böylece NeoR genini kapsayan hücreler gelişebiliyor. Ve NeoR kapsayan hücreler ile NeoR geni olmayan hücreler arasında ayrım yapılabilir.
Ek parçanın onaylanması: Hücreler in vitro şartlar altında büyüttütüldüğünde, bazı hücrelerin dönüştürülmesi veya bazı hücrelerin dönüştürülmemesi muhtemeldir. Şimdi, polimeraz zincir tepkini kullanılarak, ek doğrulanabilir. Bunun için DNA, kültürlenmiş hücrelerden ekstrakte edilir. İşaretleyici DNA dizisine has bir dizi primer, amplifikasyonun muvaffak olunması için kullanılır. Amplikonlar kollanırsa hücreler dönüştürülür, aksi takdirde deneyimiz zafersiz olur. ES hücrelerinin galibiyetli bir biçimde dönüştürüldüğünü zannedildiğinde, buna genetiği değiştirilmiş hücreler denilebilir.
Cenine enjekte etmek: Dönüştürülmüş hücreleri seçilir ve onları model organizmanın büyümekte olan ceninine yerleştirilir. Basmakalıp biçimde gelişmesine izin verilir. Gen Nakavtı Yöntemi
Model fare tercihi: Model organizmanın cenininde iki cins hücre popülasyonu vardır, biri kaba tip ve ötekiyi değiştirilmiş dönüştürülmüş hücreler, bu hayvana kimerik denir. Kimerik hayvan genetik olarak değiştirilmiş vaziyettedir, bir sonraki adımda, onu iki değişik genotipin yavrularını üreten basmakalıp hayvanla çiftleştirilir ve biri homozigot basmakalıp veya homozigot değiştirilmiş genotipe sahip başka bir hayvan ve aynı zamanda heterozigot elde edilir.
Netice: Artık gen nakavt hayvanı inşa edilmiş vaziyettedir ve bilim adamları onu ilgilenilen genle alakalı değişik parametreleri ölçmek için araştırabilirler. Genle alakalı fiziksel, biyokimyasal veya genetik parametreler araştırılabilir. Bundan sonra, PCR amplifikasyon usulü kullanılarak, gen nakavtının neticeleri doğrulanabilir.

Gen Nakavtı Nasıl Doğrulanır?

Gen nakavtının doğrulanması, tüm deneyin çok ehemmiyetli bir parçasıdır. Bunu yapmak için bir hayli değişik usul kullanılsa da, günümüzde popüler usullerden biri, polimeraz zincir tepkinidir. Polimeraz zincir tepkini, yaygın olarak kullanılan usullerden biridir ve çoğu deney için en emindir. Burada, gen nakavtını doğrulamak veya onaylamak için iki primer seti kullanılır. Bir primer seti, maksat sekansın komşu bölgelerinden planlanır ve öteki primer seti, markör gen sekansı, başka bir deyişle antibiyotik mukavemet geni için planlanır.
Deneyin ehemmiyetli neticelerinden biri maksat gen yine birleştirilirse, antibiyotik gen maksat genoma aktarılır. Bu sebeple, işaretleyici genin bitiricisi olan primer seti ile PCR tepkininde DNA bandı elde edersek deneyimiz galibiyetli olur. Öteki yandan, maksat gen çıkarıldıktan sonra, ilgilenilen gene özel abluka etme primerleri arttırılamaz ve DNA bandı elde edilemez. Bununla beraber, bir hakimiyet tepkini olarak yabani tip DNA kullanılmaktadır, böylece primer seti 1 ile bir DNA bandı elde edilebilir. Amplifikasyon tepkini bitirildikten sonra neticeler, agaroz jel elektroforezi kullanılarak doğrulanır. PCR’nin neticeleri % 2 agaroz jelde görselleştirilebilir.

Gen Nakavtı İçin Neden Fareler Seçilir?

Bir genin işlevini araştırmak için yaratılmış, tesirsizleştirilmiş alakalı gene sahip farelere nakavt fareler denir. Fareleri, insan ve fare genleri arasındaki eşliklerden dolayı genetik mühendisliği çalışmalarında ve nakavt çalışmalarında kullanılmaktadır. İnsan ve fare genlerinin% 99’u eştir, bu sebeple deney için insan ceninini doğrudan kullanmak yerine fareleri kullanmak usluca bir karardır. İnsan cenin çalışmaları ile ilişkili birkaç etik mesele sebebiyle, bilim adamları fareleri gen nakavt çalışmaları için kullanılmaktadırlar.

ZİYARETÇİ YORUMLARI

Henüz yorum yapılmamış. İlk yorumu aşağıdaki form aracılığıyla siz yapabilirsiniz.

BİR YORUM YAZ