Site Rengi

BilgiliUsta.com | Aradığınız Her Bilginin Adresi.

Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır?

  • 23 Nisan 2021
  • Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır? için yorumlar kapalı
  • 21 kez görüntülendi.
Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır?

Çok rakamda tıbbi uygulama ve bilimsel çalışmalar için kan ya da başka misallerde karmaşık halde bulunan hücre grubundan emin bir hücre cinsini ayırt etmeye ve tahlile gereksinim dinlenir. Misalin; hastalık tanısı için kandan yalnızca lenfosit adlı kan hücrelerinin ayrıştırılıp araştırılması gerekebilir. Bu operasyonu yapabilmek için akım sitometrisi isimli bir makine kullanılır. Tarihsel olarak, geliştirilen ilk […]

Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır?Çok rakamda tıbbi uygulama ve bilimsel çalışmalar için kan ya da başka misallerde karmaşık halde bulunan hücre grubundan emin bir hücre cinsini ayırt etmeye ve tahlile gereksinim dinlenir. Misalin; hastalık tanısı için kandan yalnızca lenfosit adlı kan hücrelerinin ayrıştırılıp araştırılması gerekebilir. Bu operasyonu yapabilmek için akım sitometrisi isimli bir makine kullanılır.

Tarihsel olarak, geliştirilen ilk akım sitometrisi hücrelerin ebadını tespit edebiliyordu. Günümüzde ise bu makineler oldukça gelişmiştir ve 14 parametreyi eş zamanlı olarak tespit etme kapasitesine sahiptirler. Akım sitometrisi; tek bir hücrenin ya da mikroorganizmalar, nükleus, kromozomlar gibi öteki partiküllerin ışık kaynağının önünden geçerken optik ve ışınım özelliklerini tespit edebilir. Böylece, hücreleri inceleme etmek ve birbirinden ayırmak için ebat, antikor ya da boyalardan kaynaklı ışınım özellikleri gibi parametreler kullanılır. Akım sitometrisinin altında uyuyan ilke; ışığın saçılması ile ve ışığın kaynaktan çıktıktan sonra hareketli bir parçacığa çarptıktan sonra ortaya çıkan ışık olan ışınım emisyonu ile ilişkilidir. Elde edilen bilgi, parçacıkların biyokimyasal, biyofiziksel ve moleküler güzergahlarıyla alakalı ehemmiyetli bilgiler verebilir. Floresan proptan türevli ışınım emisyonu, hücre ve hücresel bileşenlere bağlanabilen floresan probun ölçüyü ile orantılı iken, ışığın saçılması hücrenin yapısal ve morfolojik özellikleriyle ilişkilidir.

Ayırıcı olan ve ayırıcı olmayan olmak üzere iki cins akım sitometrisi vardır. Ayırıcı tipi partikülleri ayırabilirken, ayırıcı olamyan tipi ışık saçılımı ve ışınım emisyon özelliklerine sahiptir. Floresan ile aktive olan hücre ayırıcılar FACS, karmaşık bir hücre popülasyonundan floresan işaretli hücreleri ayırabilen akım sitometrileridir.

Akım sitometrisi ve hücre ayırıcıların ana bileşenleri; sıvılar, optikler, elektronik ağ detektörler ve bilgisayardır. Sıvılar; partikül kapsayan akışkanın, odaklanmış ışık kaynağına yönelmesinden mesuldür. Collection optikler, partiküldeki ışık saçılımını ya da floresan ışığı elektronik bir ağa iletirken, excitation optik hücrelerde ya da partiküllerde ışık kaynağına odaklanır. Elektronik ağ, sinyali tanımlar ve sinyali dijital bilgiye dönüştürür. Dijital bilgi ışık yoğunluğuyla orantılıdır ve bilgisayar da bilgiyi inceleme etmek için lüzumludur.

Akım sitometrisi; hücre çeperinde, sitoplazmada ve nükleusta bulunan proteinleri belirlemeye dayalı muhtelif uygulamalarda kullanılabilir. Ek olarak, tüm hücre ve organeller, nükleus, Deoksirübo Nükleik Asit, RNA, kromozomlar, sitokinler, hormonlar gibi hücresel bileşenler ve protein içeriği akım sitometrisi tarafından tespit edilebilir. Hücre artması ve hücre döngüsünün incelemeyi, kalsiyum akışının ve çeper potansiyelinin ölçülmesi, akım sitometrisi için geliştirilmiş usullerin en yaygın kullanılan misalleridir.

Akım Sitometrisinin Bileşenleri

Sıvı Sistem

Sıvı sistemi, hücreleri solüsyondan çalgıya, civar akışkanı ve tazyikli bölge hakkında bilgi elde etmek için aktarır. Civar akışkanı genellikle PBS seyreltici bir akışkandır. Bu akışkan tazyikli bölgenin merkezinde flow chamber’a enjekte edilir. Ayrıca tazyikli hava süspansiyon halindeki hücreleri misal tüpünden flow chambera enjekte eder. Hücrelerin enjeksiyon oranı inceleme emeliyle manipüle edilebilir. Misalin; yüksek akım oranı memeli hücrelerinin profilini çıkartmak gibi kalitatif ölçümler için kullanılır. Düşük akım oranı ise Deoksirübo Nükleik Asit içerik incelemeyi için uygundur. İncelemenin doğru biçimde yapılabilmesi için sıvı sistemin hava kabarcığı kapsamaması gerekiyor.

Akım Sitometrisi Nedir ve Nasıl Çalışır?Optik Sistem

Akım sitometrisi; sabit pozisyonda collection optiği, laser ve lensleri kapsayan ışık saçılımını yakalayan bir optik sisteme sahiptir. Lensler lazer ışığını odaklamak için kullanılır. Lazer hücreye çarptıktan sonra, hücrenin kenarlarından saçılır ve buna ışığın saçılması denir. Forward saçılma FCS ve side saçılma SSC olmak üzere iki cins saçılma vardır. Toplam ışık saçılmasını etkileyen etmenler; membran, nükleus, hücrenin granüllüğü, hücrenin biçimi ve yüzey özellikleridir. Genel olarak, hücrenin biçimi ve hücrenin iç yapısının kompleksliği saçılmanın tipini tanımlar. FCS, hücrenin büyüklüğünü tanımlar. SSC ise hücreden yansıyan ışıktır ve hücrenin iç yapısının kompleksliği ile orantılıdır. Heterojen bir hücre popülasyonu içerisinde hücre tiplerinin ayırtedilebilmesi için FCS ve SSC ölçümlerinin beraber kullanılması gerekir.

Akım sitometrisinde, florokromların cinsine göre muhtelif lazer yapılandırmaları vardır. FITC gibi sentetik boyaları ve alglerden elde edilen natürel boyaları uyarmak için en yaygın olarak argon lazer kullanılır.

Collection optics kısmı ise ışığı toplar ve doğrudan detektöre aktarır. Uygun bir filtre ile, floresan boyanın özelliği detektör tarafına belirlenebilir. Elde edilen bilgiler, bilgisayarda grafik olarak görüntülenebilir.

Elektrostatik Hücre Ayırma

Akım sitometrisinde evvelden belirlenmiş özelliklere göre hücreler tutulur ve ayırılır. İlgilenilen hücre cinsi bir araya geldiğinde; mikroskobik, biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar gibi ileri tahliller için kullanılabilir. Hücre ayırmak için ise; tek bir parametre ya da birkaç parametrenin kombinasyonundan faydalanılabilir. Hücre ayırmanın genel ilkeyi; hücre kapsayan yüklü taneciklerin elektrostatik sapmasını direnir. Bu usulde, sıvı içerisindeki damlalar lazer kaynağının önünden geçerken elektrotlar tarafından yüklenir. Damlalar, yüklerine göre ana akımdan saparlar. Pozitif yüklü damlalar olumsuz yüklü platin kısıma, olumsuz yüklü damlalar ise pozitif yüklü platin kısıma doğru saparlar. Yüksüz damlalar da atık kısmına bir araya gelir.

FACS; karmaşık bir hücre popülasyonundan emin bir veya daha fazla floresan işaretli hücre cinsini ayırabilen akım sitometrisi cinsidir. Sıvı lazer kaynağının önünden geçerken; floresan işaretli seçilmek istenen hücreleri bilgisayar takviyesiyle ayırır. Damladaki floresan işaretli hücreler yüklenir, yüklenen hücre tipleri değişik parçalamalara ufalar.

Işınımın İlkeyi

Bir floresan bileşim; ışık enerjisini absorblayan spesifik dalga boylarına sahiptir. Işığın absorblanması, bir elektronun temel vaziyetten yüksek enerji seviyesine geçmesine neden olur. Uyarılmış elektron süratli bir biçimde temel hale geri döner ve bu sırada fazla enerjiyi ışık fotonu olarak salar. Bu enerji geçişine floresan ismi verilir. Akım sitometrisi de hücreleri tespit etmek için floresan özelliğinden faydalanır.

Florokrom ve Özellikleri

Hücrelerdeki floresan bileşenlerin rakamı hudutludur. Bu sebeple hücreler, florokrom ismi verilen floresan problarlarla işaretlenir. Floresan problar; değişik hücre popülasyonları, hücre reseptörlerinin ve organellerinin belirlenmesi, hücre ayırma, immünofenotipleme, nükleik asit içeriğinin tanımlanması, enzim etkinliğinin ölçülmesi ve apoptotik hücre popülasyonunun tanımlanması gibi çok rakamda uygulama için kullanılır.

Akım sitometrisinde kullanılan florokromlar; proteinleri etiketlemek için kullanılan florokromlar, nükleik asitler için olan florokromlar ve reporter moleküller olmak üzere birkaç gruba bölerler. Uygun florokromun seçilmesi ehemmiyetlidir ve bu tercih kullanılacak lazere bağlıdır. Misalin; argon-iyon lazeri kullanılacaksa, ilk alternatif FITCH florokromudur.

Bilgi İncelemeyi

Akım sitometrisi data incelemeyi, biyolojik deneyler için en kritik parametre olarak değerlendirilir. Bilgi tahlilinin en ehemmiyetli ilkeyi, incelenen hücre tipinin ve özelliğinin görüntülenmesidir. Bilgisayarda görüntülenen grafikte birkaç bölge tanımlanabilir. Bu parametreler, ölü hücreler gibi istenmeyen partiküllerden kaynaklı neticelerin elenebilmesine imkân tanır. Beyaz kan hücrelerinin değişik özellikleri, granülositler, monositler ve lenfositler bu yolla birbirlerinden ayırt edilebilir. Tahlilci, yalnızca lenfositleri kapsayacak biçimde inceleme yapmak istediğinde FSC ya da hücre büyüklüğünü temel alarak, FSC SSC’ye karşı kullanılarak lenfositler inceleme edilebilir. Elde edilen netice, yalnızca lenfositlerin floresan özelliklerini gösterir. Bu sayede istenilen hücre tipi öteki hücrelerden parçalamış olur. Bölen hücreler de değişinim incelemeyi gibi başka tahliller için kullanılabilir.

ZİYARETÇİ YORUMLARI

Henüz yorum yapılmamış. İlk yorumu aşağıdaki form aracılığıyla siz yapabilirsiniz.

BİR YORUM YAZ